Quale test diagnostico scegliere e come interpretare i risultati
Esame citologico
La ricerca diretta di leishmania può essere effettuata mediante esame citologico su linfonodi, milza, midollo osseo, o su qualsiasi organo-tessuto si ritenga infetto, come ad esempio su cute o liquido sinoviale.
La sensibilità dell’esame citologico è moderata (circa 50-80% nei differenti tessuti), pertanto non trovare amastigoti non consente di escluderne la presenza. In caso di sospetto clinico di leishmaniosi con esame citologico negativo si consiglia di utilizzare la PCR che ha sensibilità molto più elevata o altri metodi indiretti.
IF – ELISA
Sia il test ELISA che l’immunofluorescenza misurano la presenza di anticorpi. Il test ELISA fornisce un numero “esatto” perché misura l’assorbanza del campione in modo spettrofotometrico. L’immunofluorescenza prevede la lettura di un vetrino da parte di un operatore e quindi ci possono essere lievi differenze di interpretazione tra un operatore e l’altro (in genere non più di 1 diluizione). Per questa ragione per dire che un titolo aumenta o diminuisce la differenza tra due titoli deve essere di almeno 3-4 diluizioni. I due metodi danno le stesse informazioni; utilizzare nello stesso paziente lo stesso metodo per monitoraggi successivi, per poter confrontare i risultati.
Il test rileva gli anticorpi prodotti in seguito sia all’infezione che all’esposizione; questi vengono prodotti 2-6 mesi dopo la puntura di flebotomo infetto. Per questa ragione si consiglia di testare i cani a partire da 4-6 mesi dopo il rischio dell’ultimo possibile contagio (es. in primavera per testare una possibile infezione avvenuta nella stagione calda precedente).
La sensibilità dell’IF per la malattia è molto elevata (< di 90%) mentre è inferiore per individuare i soggetti infetti-esposti ma clinicamente sani. La specificità è sempre stata considerata molto elevata, sebbene studi recenti ipotizzino una crossreattività nei confronti di altre leishmanie (es L. tarentolae)
L’entità del titolo può correlare con la gravità della malattia e con la carica parassitaria, ma non sempre. E’ possibile osservare titoli molto elevati in cani clinicamente sani, senza alterazioni clinicopatologiche secondarie a leishmaniosi, che sono stati esposti ma non sono infetti; in questi pazienti è possibile per differenziare esposizione da infezione ricercare in PCR la leishmania su linfonodi, milza o midollo osseo.
Seppure raramente è possibile che la ricerca di anticorpi in cani malati dia esito negativo; quando il sospetto clinico e clinicopatologico di malattia sistemica sono alti si consiglia di ricercare leishmania in PCR su milza, linfonodi o midollo osseo.
Nel caso si sospetti una forma localizzata (ad esempio cutanea o articolare, ma anche in altre sedi come osso o intestino) è possibile che la ricerca di anticorpi risulti negativa; in questi casi si consiglia la ricerca diretta degli amastigoti sui tessuti dei quali si sospetta il coinvolgimento (ad es prelievi cutanei o su liquido sinoviale) con esame citologico (sensibilità moderata) o mediante PCR (maggiore sensibilità).
Un singolo titolo anticorpale anche se molto elevato in un paziente sano (clinicamente e in assenza di alterazioni di laboratorio) non consente di diagnosticare con certezza né l’infezione né la malattia; i titoli devono essere interpretati unitamente al quadro clinico e agli altri esami di laboratorio; un titolo elevato in un paziente con segni clinici e alterazioni clinicopatologiche tipici consente di diagnosticare la leishmaniosi con elevata probabilità.
MONITORAGGIO
Per monitorare la risposta alla terapia si consiglia di richiedere la valutazione delle proteinuria (PU/CU, da valutare sempre in associazione all’esame completo delle urine), l’esame emocromocitometrico (in particolar modo se erano presenti citopenie al momento della diagnosi), l’elettroforesi sierica e un profilo biochimico possibilmente completo, oppure ridotto ma che comprenda parametri renali e proteine di fase acuta). Tutti questi parametri possono essere richiesti entro il primo mese dalla fine del trattamento. Il titolo anticorpale può diminuire più lentamente o talvolta non diminuire dopo la terapia, e si consiglia di misurarlo a partire da 2-3 mesi dopo la fine della terapia.
Per monitorare una eventuale comparsa di recidiva tutti i parametri indicati qui sopra possono essere richiesti ogni 3-4 mesi inizialmente e poi ogni 6 mesi; gli intervalli di monitoraggio variano in realtà sulla base del quadro clinico, dello stadio iniziale di malattia e della risposta alla terapia.
PCR
La tecnica di PCR è stata ampiamente utilizzata per la ricerca di L. infantum da diverse matrici biologiche. I campioni di midollo e linfonodo sono quelli che risultano più sensibili in corso di infezione sistemica nel cane; mentre, nelle forme cutanee, il parassita è maggiormente presente nella cute, che andrà campionata per l’esame di PCR; il tampone orale ed il tampone oculo-congiuntivale sembrano avere una buona sensibilità, mentre il sangue è la matrice meno sensibile.
La PCR per L. infantum è di tipo qualitativo, con esito positivo/negativo; altrimenti anche di tipo quantitativo (qPCR) con esito positivo/negativo e con l’indicazione della carica parassitaria rilevata.
La tecnica di qPCR permette di monitorare il decorso della malattia, ad esempio effettuando la misurazione della carica parassitaria ad inizio terapia e poi alla fine, per valutarne l’efficacia.
Con un risultato positivo alla PCR possiamo confermare l’infezione da L. infantum.
Mentre, con un risultato negativo alla PCR non possiamo escludere l’infezione da L. infantum, in quanto l’esito dell’analisi dipende dalla scelta della matrice biologica più idonea in base allo stadio dell’infezione.
La PCR per la ricerca di L. infantum trova il suo migliore utilizzo in combinazione con i test sierologici.