TEST DI KNOTT

E’ una tecnica di concentrazione utilizzata per l’identificazione delle microfilarie nel sangue, consentendo di rilevare il parassita anche in situazioni di basso carico parassitario, dove altri metodi, come lo striscio diretto, potrebbero non rilevarne la presenza.Non è solo uno strumento diagnostico, ma un vero e proprio alleato nella battaglia contro la filariosi. La sua capacità di concentrare e visualizzare le microfilarie nel sangue permette di identificare con precisione le specie circolanti, fornendo informazioni vitali per una diagnosi accurata.

Tuttavia, la specificità del test dipende dall’esperienza e dall’occhio dell’operatore. Per questo motivo, una conoscenza approfondita delle differenze morfologiche tra le microfilarie di Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens è fondamentale.

Le microfilarie di D. immitis sono solitamente più lunghe e sottili, mentre quelle di D. repens presentano una forma più tozza e robusta.La presenza di altre specie come Acanthocheilonema reconditum può complicare ulteriormente il quadro diagnostico.

La corretta differenziazione tra Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens non è solo importante, è cruciale. Queste due specie di nematodi zoonotici trasmessi da zanzare causano manifestazioni cliniche molto diverse: la filariosi cardiopolmonare nel caso di Dirofilaria immitis e la filariosi sottocutanea per Dirofilaria repens.

Procedura:

Al campione di sangue intero, raccolto in una provetta contenente K3EDTA, viene aggiunta acqua distillata. Questa fase consente di favorire la lisi delle cellule ematiche e migliorare la visibilità delle microfilarie presenti. Successivamente, il campione viene centrifugato per separare il sedimento dal surnatante, e aggiunta una soluzione di blu di metilene allo 0,1%, utile per colorare e rendere più evidente la struttura delle microfilarie. Alcune gocce del sedimento colorato vengono poste su un vetrino portaoggetti e coperte con un vetrino coprioggetti per creare il preparato. Questa operazione viene ripetuta, assicurandosi che tutto il campione venga esaminato.

I vetrini così preparati vengono analizzati al microscopio ottico con ingrandimenti di almeno 10x. Le microfilarie identificate vengono sottoposte a un esame morfometrico per determinare la specie, valutando parametri come lunghezza, larghezza, caratteristiche della testa e della coda, e la presenza o assenza di uncini cefalici, caratteristica utile per una diagnosi accurata delle specie come Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens.

Diagnosi della Filariosi

Per la diagnosi della filariosi, si raccomanda di eseguire oltre al Test di Knott anche il Test antigenico che rileva le proteine rilasciate dalle femmine adulte di D. immitis. Questo metodo ha una sensibilità e specificità elevate (>95%) e può identificare infezioni occulte (in assenza di microfilarie).L’utilizzo combinato del Test di Knott e del test antigenico garantisce una diagnosi più completa e accurata. Questa strategia diagnostica consente infatti di rilevare di:

Rilevare sia le infezioni manifeste (con microfilarie) sia le infezioni occulte (assenza di microfilarie ma presenza di antigeni).
Identificare falsi negativi o positivi derivanti da particolari condizioni, come il basso carico parassitario o la presenza di antigeni mascherati.
Guidare il trattamento e la stadiazione clinica del paziente, migliorando l’accuratezza della diagnosi e ottimizzando l’approccio terapeutico per ogni singolo caso.

L’esecuzione congiunta dei due test risulta quindi cruciale per un controllo efficace e completo della filariosi, migliorando la capacità di intervenire precocemente e adeguatamente a beneficio della salute del paziente.

Interpretazione dei Risultati

Knott negativo e antigenico negativo: NEGATIVO.

Falsi negativi potrebbero derivare da infestazioni recenti, giovene età dell’animale (fino a 6 mesi), periodo durante il quale le microfilarie non sono ancora rilevabili. Suggerimento: ripetere il test dopo 7 mesi per una conferma definitiva

Knott positivo e antigenico positivo: POSITIVO.

Indica una diagnosi confermata di filariosi.Si raccomanda la stadiazione del paziente per valutare il grado di coinvolgimento cardiopolmonare tramite radiologia toracica ed ecocardiografia

Knott positivo e antigenico negativo: POSITIVO. Un risultato antigenico falsamente negativo può verificarsi nei seguenti casi:

– infestazione con poche femmine adulte (2-3), che non producono una quantità di antigeni sufficiente per la rilevazione

– infestazioni con soli adulti maschi

– periodo di prepatenza (circa 7 mesi), durante il quale le femmine non hanno ancora rilasciato antigeni rilevabili

– antigen masking o copertura degli antigeni circolanti dovuta alla presenza di anticorpi, che formano complessi con gli antigeni del parassita, ostacolando la loro rilevazione

Knott negativo e antigenico positivo: POSITIVO. Il test di Knott può risultare falsamente negativo in caso di:

– infestazioni di parassiti costituiti esclusivamente da macrofilarie (assenza di microfilarie circolanti), quindi solo maschi o solo femmine

– trattamento recente con lattoni macrociclici

– microfilaremie di lieve entità, insufficienti per essere rilevate

-Il test antigenico può presentare falsi positivi per reazioni crociate con altri nematodi come Angiostrongylus vasorum, Dirofilaria repens, o altri parassiti simili.

Importanza dell’Esecuzione di Entrambi i Test

L’utilizzo combinato del Test di Knott e del test antigenico garantisce una diagnosi più completa e accurata. Questa strategia diagnostica consente di:

Rilevare sia le infezioni manifeste (con microfilarie) sia le infezioni occulte (assenza di microfilarie ma presenza di antigeni).
Identificare falsi negativi o positivi derivanti da particolari condizioni, come il basso carico parassitario o la presenza di antigeni mascherati.
Guidare il trattamento e la stadiazione clinica del paziente, migliorando l’accuratezza della diagnosi e ottimizzando l’approccio terapeutico per ogni singolo caso.